Bases Moleculares de la Hemofilia B

Bases moleculares de la Hemofilia B

La hemofilia B, caracterizada por una deficiente actividad del FIX, es unas 5-6 veces menos frecuente que la hemofilia A y se estima que afecta a unas 15-20 personas por millón. Un 80% de los niños afectos son graves, un 5% moderados y un 15% leves (Sadler y Davie, 1994). Al igual que el FVIII, el FIX participa en la fase intermedia de la vía intrínseca de coagulación. Es sintetizado en el hígado y circula inactivo en plasma a una concentración media de 2-5 ug/ml en forma de una única cadena polipeptídica de 415 aminoácidos y unos 56 KDa, de los cuales el 20% corresponden a carbohidratos. Su vida media es de unas 24 horas aproximadamente (Nilsson, 1994).
El FIX es una serin-proteasa que se activa tras sufrir una proteolisis específica por el FXIa o por el complejo FVIIa-FT. Una vez activado, el FIXa puede formar el complejo de activación del FX uniéndose al FVIIIa, fosfolípidos de superficie y Ca2. La existencia en las células endoteliales de receptores con alta afinidad para el FIX asegura una eficiente y localizada activación del FX por el complejo FIXa-FVIIIa, que actúa como una unidad. Resulta por tanto lógico que las hemofilias A y B presenten una gran similitud clínica, dado que son el resultado de alteraciones moleculares que afectan la función de dos componentes diferentes que forman parte de un mismo complejo.

Figura 1: Localización y organización genómica del gen FIX.

El gen FIX se encuentra localizado en la región telomérica del brazo largo del cromosoma X, en la banda Xq27 (Chance y col., 1983). En la misma región, en posición distal, se encuentran los loci correspondientes a los genes FMR-1 (su alteración provoca el desarrollo del Síndrome del cromosoma X frágil) y FVIII (Purrello y col., 1985). Tal y como se indica en la Figura 1 el gen FIX, clonado en 1982, tiene un tamaño cercano a las 34 Kb y consta de 8 exones y 7 intrones (Anson y col., 1984; Choo y col., 1982; Kurachi y Davie, 1982; Yoshitake y col., 1985). El tamaño de los exones varía entre los 25 nucleótidos del exón 3 y los 1935 nucleótidos del exón 8. Los intrones también presentan una gran heterogeneidad en su longitud, siendo de tan solo 188 nucleótidos en el intrón 2 y de 9473 nucleótidos en el intrón 6. El gen contiene 4 secuencias Alu, de las cuales una se encuentra en el intrón 1 y las 3 restantes en el intrón 6. Inmediatamente después del gen FIX se sitúa una quinta secuencia Alu, en posición 3’ flanqueante.
En la región promotora del gen FIX se encuentran diversas secuencias de unión a elementos trans tales como el HNF-4 (Hepatic Nuclear Factor 4), el C/EBP (CCAAT/Enhancer Binding Protein), el DBP (D-site Binding Protein) y el NF-1L (Nuclear Factor 1-Liver) (High y Roberts, 1995). Sin embargo el promotor carece de la secuencia TATA consenso, habiéndose además identificado diversos inicios de transcripción (Reijnen y col., 1990). A pesar de que existe cierta controversia, el inicio más frecuente parece ser el que se encuentra a 29 nucleótidos del primer codón ATG (Lillicrap, 1998).
Los ocho exones dan lugar a un total de 7 dominios funcionales y, prácticamente, cada exón codifica un dominio. Así, el exón 1 corresponde al péptido señal, el exón 2 al propéptido y a la región Gla, el exón 3 codifica para una región rica en aminoácidos aromáticos que hace de puente entre los dominios adyacentes, el exón 4 da lugar a la región EGF-1, el exón 5 a la región EGF-2, el exón 6 codifica para el péptido de activación y finalmente los exones 7 y 8 corresponden al dominio proteasa o catalítico (Roberts, 1993).
Existen tres inicios potenciales de traducción localizados en las posiciones –46, -41 y –39 relativas al comienzo de la proteína madura, por lo que la longitud exacta del péptido señal es aún desconocida. Éste es el encargado de guiar al FIX inmaduro a través del retículo endoplasmático, donde es procesado por una peptidasa entre los residuos Cys-19 y Thr-18, eliminando el péptido señal. A continuación se encuentra la región del propéptido, que comprende los residuos –18 a –1 y que posibilita el reconocimiento intracelular y la modificación postraduccional del dominio contiguo (Tuddenham y Cooper, 1994).
El comienzo de la proteína madura se caracteriza por un dominio de 40 aminoácidos rico en ácido g-carboxiglutámico conocido como dominio Gla. Sus doce residuos de ácido glutámico son carboxilados por una carboxilasa dependiente de vitamina K y juegan un papel fundamental en la unión del FIX al Ca2. Dominios homólogos del tipo Gla se hallan también en otras proteínas dependientes de vitamina K, presentando una secuencia altamente conservada, lo cual es coherente con el hecho de que todas ellas se unen también al Ca2. Los residuos 3 a 11 están directamente implicados en la unión a la membrana de la célula endotelial (Cheung y col., 1992).
Los dominios EGF-1 y EGF-2 tienen esta denominación por presentar una gran homología con los del factor de crecimiento epidérmico (Epidermal Growth Factor). Ambos están situados en tándem y comprenden los residuos 48 a 127. Dominios similares se encuentran en otras serín-proteasas como el FX, uroquinasa y FXII. En EGF-1 se encuentra una región de alta afinidad por el Ca2, al igual que en el dominio Gla (Handford y col., 1991). En la posición 64 se encuentra un poco común residuo de ácido b-hidroxiaspártico, resultado de la hidroxilación post-traduccional del ácido aspártico. Esto ocurre en un 25% de las moléculas de FIX y su función, si es que la tiene, se desconoce aún.
El péptido de activación, el dominio contiguo a los EGF1 y 2, es el dominio menos conservado entre las serín-proteasas. Consta de 35 aminoácidos comprendidos entre los residuos Arg145 y Arg180, sobre los cuales actúa el FXIa. Sin embargo, sólo el corte proteolítico en Arg180 da lugar a la actividad catalítica del FIXa. Los residuos Thr159 y Thr169 se encuentran O-glicosilados (Agarwala y col., 1994).
El dominio proteasa o catalítico del FIX corresponde al de una típica serín-proteasa. Es el dominio más grande y se extiende desde el residuo 181 al 415. El centro activo contiene, al igual que en la mayoría de las proteínas de esta familia de enzimas, los residuos His221, Asp269 y Ser365. Las secuencias aminoacídicas que flanquean estos tres residuos están también muy conservadas. Este es el caso de la posición 359 correspondiente a la zona de unión al sustrato, donde se encuentra una Asp imprescindible para conferir la especificidad proteolítica. La rotura del enlace peptídico entre Arg180 y Val181 permite a este último residuo interaccionar con Asp364, lo que ocasiona un cambio conformacional y un aumento de la actividad catalítica de la proteína (Green y col., 1995).

Cuando el FIX interacciona con el FXIa o con el complejo FT-FVIIa para ser activado, el enlace Arg145-Ala146 se rompe de inmediato generando una forma inactiva denominada FIXa cuyas dos cadenas permanecen unidas por un enlace bisulfuro. La activación de FIXa tiene lugar tras una segunda proteolisis a nivel de Arg180 en el péptido de activación, dando lugar a la forma FIXaa activa. Sin embargo, algunas de las moléculas de FIX no sufren el primer corte en Arg145 pero sí el segundo en Arg180 dando lugar a la forma FIXab. Esta última no posee las mismas propiedades coagulantes que FIXab, siendo menos efectiva en su interacción con los fosfolípidos. Así pues, el paso limitante que determina el nivel de activación global del FIX viene dado por la tasa de proteolisis de Arg145 y de Arg180 puesto que condiciona la proporción final de moléculas FIXaa y FIXab presentes (Lindquist y col., 1978). Si bien no del todo esclarecido aún, parece ser que la activación del FIX por FT-FVIIa es mayor que la efectuada por el FXIa. Ello viene corroborado por el hecho de que en casos de deficiencia congénita de FVII se observa una notable reducción de la concentración del péptido de activación del FIX, lo cual no parece ocurrir en pacientes con deficiencias congénitas de FXI (Sadler y Davie, 1994).