Bases moleculares de la hemofilia A
 

El FVIII es una proteína que en su forma inmadura tiene un tamaño de 2351 aminoácidos, incluyendo un péptido señal de 19 residuos. Tras su procesamiento la forma madura, de 2332 aminoácidos y con un peso molecular estimado de 265 KDa (sin tener en cuenta las modificaciones postranscripcionales), circula en plasma asociada de forma no covalente al Factor von Willebrand (FvW) a una concentración que normalmente oscila entre los 150 y los 200 ng/ml. El FvW actúa como molécula transportadora del FVIII, asegurando su correcta secreción así como su protección frente a la degradación proteolítica. Además, dicha asociación asegura la correcta localización de cantidades suficientes de FVIII en las zonas expuestas del subendotelio donde ha de actuar, gracias a la capacidad del FvW para fijarse a éste y a determinadas glicoproteínas plaquetares.
 

 

 

 

El gen FVIII

El gen FVIII se encuentra en la porción telomérica distal del brazo largo del cromosoma X, en la banda Xq28 (Poustka y col., 1991). Fue caracterizado en 1984 (Gitschier y col., 1984), y resultó ser el gen más grande y complejo conocido hasta entonces (Figura 1). Consta de 26 exones que se extienden a lo largo de unas 186.000 bp en el genoma humano y que dan lugar a un mRNA de prácticamente 9 Kb, incluyendo 7.053 nucleótidos codificantes (Toole y col., 1984; Wood y col., 1984). Veinticuatro de los exones tienen un tamaño que varía entre las 69 y las 262 bp, mientras que los dos restantes, los exones 14 y 26, contienen 3106 y 1958 bp respectivamente. La mayor parte del exón 26 corresponde a secuencia transcrita y no traducida. De los 25 intrones 6 tienen más de 14 Kb, uno de los cuales, el intrón 22, contiene dos genes denominados F8A y F8B que no parecen tener ninguna vinculación fisiológica con el gen huésped. F8B se transcribe en la misma dirección que el gen FVIII y da lugar a un mRNA de 2.5 Kb que incluye un exón propio y los exones 23 a 26 del gen FVIII (Levinson y col., 1992). Por su parte, el gen F8A no contiene intrones y se transcribe en sentido opuesto (Levinson y col., 1990). A unas 400 Kb en posición telomérica distal del gen FVIII se encuentran dos copias del gen F8A, con una homología cercana al 100% y cuya presencia, como se explica más adelante, es la responsable de casi el 50% de las hemofilias A graves (Lakich y col., 1993). Si bien los tránscritos del gen F8A han sido detectados en una amplia variedad de tejidos, su función es todavía desconocida. El gen F8B parece estar relacionado con mecanismos de desarrollo embrionario según se desprende de estudios realizados en ratones quiméricos y transgénicos (Valleix y col., 1999).

 

Figura 1: Localización y organización genómica del gen FVIII.

 

 

Estructura del FVIII

La estructura del FVIII, deducida a partir de la secuencia nucleotídica, consta de 6 dominios del tipo A1-A2-B-A3-C1-C2 (Vehar y col., 1984). Presenta una homología aminoacídica de alrededor del 40% con 5 de los 6 dominios de que también consta el factor V de coagulación, y cuya disposición también es similar. Sin embargo el dominio B parece no estar relacionado. El FVIII comparte asimismo homología con la ceruloplasmina, cuya estructura es del tipo A1-A2-A3 y con cuyos dominios presenta una homología media del 35% (Church y col., 1984). Por su parte, los dominios C1 y C2 también parecen presentar una cierta relación con otras proteínas como las lectinas. Respecto al dominio B, no se ha encontrado hasta el momento homología significativa con ninguna de las diversas secuencias proteicas existentes en las bases de datos (Kemball-Cook y Tuddenham, 1997; Lenting y col., 1998).
El FVIII es muy sensible al procesamiento proteolítico. Mayoritariamente circula asociado al FvW en forma de dos cadenas, una pesada que incluye los dominios A1-A2-B y otra ligera A3-C1-C2, unidas de forma no covalente mediante la interacción de iones Ca2 y Cu2. Aunque existen ligeras discrepancias en la bibliografía, el modelo de delimitación de los diferentes dominios más ampliamente aceptado es el de Vehar y colaboradores (Vehar y col., 1984). Según éste, los dominios se acotan según las siguientes coordenadas: A1 entre los residuos 1 y 328; A2 entre 380 y 711; B entre 712 y 1648; A3 entre 1694 y 2019; C1 entre 2020 y 2172; C2 entre 2173 y 2332. Existen además dos regiones ricas en aminoácidos ácidos: una entre los dominios A1 y A2 (región a1) que contiene 15 ácidos aspártico y glutámico y parece estar implicada en la actividad procoagulante del FVIII; otra entre los dominios B y A3 (región a2), también rica en dichos aminoácidos y que contiene la zona de unión al FvW.
 

 

Síntesis del FVIII

La determinación del lugar de biosíntesis de FVIII en el organismo ha sido un tema especialmente controvertido. Se ha demostrado la presencia de mRNA del FVIII en diversos órganos tales como bazo, páncreas y riñón (Wion y col., 1985). Sin embargo el hígado es el órgano productor de FVIII por excelencia, más concretamente las células sinusoidales y en menor medida los hepatocitos (Hollestelle y col., 2001). A pesar de que otros órganos como el bazo y el riñón expresan cantidades similares de mRNA por gramo de tejido, el gran tamaño del hígado lo convierte en la principal fuente de FVIII (Wion y col., 1985). Una clara demostración se encuentra en el hecho de que pacientes hemofílicos sometidos a trasplante hepático recuperan los niveles de FVIII hasta valores de normalidad (Bontempo y col., 1987; Lewis y col., 1985). Además, el promotor del gen FVIII contiene secuencias características de expresión específica de hepatocitos (Figueiredo y Brownlee, 1995).
 

 

Modificaciones postraduccionales

Una vez traducido, el FVIII inicia su procesamiento en el lumen del retículo endoplasmático, donde es N-glicosilado a nivel de sus 25 puntos de glicosilación potenciales, 19 de los cuales se encuentran en el dominio B. Interacciona asimismo con diversos chaperones, incluyendo la calreticulina, la calnexina y la BiP (Ig-Binding Protein) (Marquette y col., 1995; Pipe y col., 1998; Swaroop y col., 1997). Debido a esta interacción una proporción significativa de las moléculas de FVIII son retenidas en el retículo endoplasmático, limitando así su transporte al aparato de Golgi. En dicho transporte se encuentra implicada una lectina intracelular de membrana denominada de forma abreviada ERGIC-53 (Endoplasmatic Reticulum-Golgi Intermediate Compartment-53). Mutaciones en el gen que la codifica dan lugar a deficiencias combinadas de FV y FVIII (Nichols y col., 1998). Una vez en el aparato de Golgi el FVIII sufre varias modificaciones postraduccionales adicionales: modificación de las N-glicosilaciones previas, O-glicosilaciones y adición de grupos sulfato en 6 residuos de tirosina (Lenting y col., 1998).
Previa a su secreción al torrente circulatorio el FVIII es sometido a proteolisis intracelular. En las regiones central y carboxiterminal del dominio B se encuentra el motivo Arg-X-X-Arg, el cual es reconocido por proteasas intracelulares de la familia de las subtilisinas (Hutton, 1990). Si bien la endoproteasa responsable no ha sido aún identificada, la proteolisis se realiza a nivel de Arg1313 y de Arg1648. Este último corte rompe la unión covalente entre las cadenas pesada y ligera, dando lugar a una molécula heterodimérica de unos 330.000 Da (incluyendo las modificaciones post-traduccionales) estabilizada por Ca2 y Cu2, tal y como ya se ha mencionado anteriormente (Fay y Smudzin, 1992). De forma inmediata a su secreción al torrente sanguíneo, el FVIII se une de forma no covalente a los multímeros de FvW, en una proporción de una molécula de FVIII por cada 50 monómeros de FvW (cada multímero de FvW puede constar de hasta 200 monómeros) (Leyte y col., 1989; Vlot y col., 1995). Este número se explica por las cantidades limitantes de FVIII disponible. Dos regiones peptídicas son las responsables de la unión con el FvW: la región aminoterminal de la cadena ligera del FVIII (Saenko y Scandella, 1997) y la comprendida entre los residuos 2303-2332 en el extremo carboxiterminal de la misma (Shima y col., 1993). Uno de los aspectos funcionales de la interacción FVIII-FvW parece ser la prevención de uniones prematuras del FVIII con los componentes del complejo FXa. Así, la unión de la cadena ligera del FVIII al FIXa está inhibida por el FvW. De hecho la afinidad por éste último es de unas 100 veces superior a la que presenta por el FIXa (Lenting y col., 1994). También se ha demostrado que unido al FvW, el FVIII es menos susceptible al ataque proteolítico de varias proteasas, incluyendo la PCa y el FXa (Fay y col., 1991; Rick y col., 1990). Esta asociación con FvW juega un papel fundamental en la fisiología del FVIII al estabilizar su estructura heterodimérica. Sin embargo esto no ocurre con el FIIa, el cual tras actuar sobre el FVIII permite que éste adopte su conformación activa separándolo del FvW (Esmon y Lollar, 1996).
 

 

Activación e inactivación del FVIII

El FVIII es un cofactor esencial en la activación del FX dado que aumenta en unas 20.000 veces la actividad proteolítica del FIXa. Para ello el FVIII debe sufrir diversas roturas en las cadenas pesada y ligera. Las enzimas encargadas de hacerlo son el FIIa y el FXa. El FIIa actúa sobre la posición Arg1689 de la cadena ligera del FVIII mientras que en la cadena pesada corta en los residuos Arg372 y Arg740 (Eaton y col., 1986). La proteolisis a cargo del FXa tiene lugar en Arg336 (implicada en la inactivación del FVIIIa), Arg372, Arg740 en la cadena pesada y Arg1689, Arg1721 en la cadena ligera (3 de sus 5 dianas son compartidas por FIIa). El corte a nivel de los residuos Arg372, situado en la interfase que separa los dominios A1/A2, y Arg1689 es esencial para una total actividad del FVIIIa (Regan y Fay, 1995). Ambos residuos se encuentran en las anteriormente mencionadas regiones acídicas a1 y a2 respectivamente, y aparte de su papel en la activación por FIIa, estas regiones también cumplen otras funciones en el ciclo de activación del FVIII. La región a1 está implicada en la estabilidad del heterodímero y en la unión con el FX (Fay y col., 1993; Lapan y Fay, 1997; Regan y col., 1996). La región a2, que contiene una secuencia acídica de 40 aminoácidos, es el punto de unión del FvW. La escisión a nivel de la Arg1689 permite la disociación del FVIII de su transportador, pudiendo entonces interactuar con la superficie fosfolipídica a través de su dominio C2 y formar un macrocomplejo con FIXa y FX (Mathur y col., 1997). En presencia de fosfolípidos el FVIIIa induce un cambio conformacional en el dominio proteasa del FIXa, posiblemente a través de la interacción con el dominio A2 de aquél (Mutucumarana y col., 1992).
Subsiguientes degradaciones proteolíticas por parte de la PCa, el FIIa, el FIX o el FX en diversas posiciones del FVIIIa, tales como Arg336 y Arg562, dan lugar a su inactivación (Lenting y col., 1998). Ello es de vital importancia una vez se ha iniciado el proceso dado que una excesiva coagulación produciría fenómenos trombóticos contraproducentes para el organismo, en algunos casos posiblemente más dañinos que la propia hemorragia.
 

 

La inversión del intrón 22

A partir de la clonación del gen FVIII en 1984 diversos grupos inician la búsqueda de las mutaciones responsables de la enfermedad en los pacientes afectos de hemofilia A. La descripción de la técnica de la PCR agiliza tremendamente dicha búsqueda. Higuchi y colaboradores, en los inicios de la década de los 90, caracterizaron el defecto genético en la mayoría de los hemofílicos moderados y leves que habían analizado (Higuchi y col., 1991). Sin embargo no ocurría así con los pacientes que padecían de hemofilia A grave. De manera inesperada, fueron incapaces de identificar la mutación en cerca del 50% de los casos (Higuchi y col., 1991), lo cual concordaba con las observaciones de otros laboratorios. Ello dio lugar a la aparición de hipótesis tales como la posible existencia de uno o más genes adicionales implicados en la enfermedad, cuyo desconocimiento explicaría la gran proporción de estudios fallidos.
En 1992 Naylor y colaboradores dieron la primera pista para clarificar el misterio. Basándose en la técnica de la RT-PCR Naylor obtuvo, a partir de sangre periférica de algunos de los enfermos no caracterizados, diversos amplímeros que incluían los exones 1 a 22 y 23 a 26. Pero no pudo obtener amplímeros que incluyeran los exones 22 y 23 en un mismo producto (la sangre no es un tejido productor de FVIII, sin embargo la transcripción ilegítima por parte de los linfocitos permite que cantidades ínfimas sean detectables gracias a la extrema sensibilidad de la PCR). Parecía claro que algo ocurría entre ambos exones, en el intrón 22, y que en éste debería de encontrarse la solución al problema (Naylor y col., 1993).
Unos años antes Gitschier y colaboradores habían hallado, en el interior de las 32 Kb del intrón 22 de individuos sanos, dos genes que denominaron F8A y F8B y que en aquellos momentos suponían los primeros genes “intrónicos” descubiertos en el genoma de mamíferos (en la página 24 se describen con más detalle aspectos relacionados con su orientación y expresión). Uno de estos genes, el gen F8A, presentaba además dos copias altamente homólogas en la porción telomérica distal a unas 400 Kb del gen FVIII: los denominados F8A’ y F8A’’. A raíz de los experimentos de Naylor, Gitschier pensó en la posibilidad de que se hubiera producido una recombinación homóloga desigual entre el gen F8A intrónico y alguna de sus copias teloméricas en los hemofílicos graves cuya mutación no había podido ser identificada. Si esto ocurría, el gen FVIII quedaría dividido en dos mitades muy distanciadas una de la otra, orientadas en sentido opuesto, y explicaría los tránscritos inconexos que había encontrado Naylor. Para probarlo construyeron una sonda marcada dirigida contra el gen F8A y mediante la técnica de Southern Blot comprobaron que, efectivamente, el patrón de bandas cambiaba en los individuos problema respecto al de individuos control. En 1993 ambos grupos publicaban simultáneamente el descubrimiento (Lakich y col., 1993; Naylor y col., 1993).
En la Figura 2 se presenta de forma esquemática el proceso que da lugar a la inversión del intrón 22. Ello requiere de la torsión del extremo del brazo largo del cromosoma X para permitir el encuentro de las regiones homólogas y que se pueda producir la recombinación, cuya frecuencia estimada es de aproximadamente 4 x 10-6. Los genes implicados en la recombinación (F8A, F8A’ y F8A’’) tienen un tamaño aproximado de 9 Kb y una homología cercana al 100%. Cuando la recombinación involucra al gen F8A’, la copia más cercana al gen FVIII la inversión se denomina proximal o de tipo 1 (78% de los casos). Cuando el gen implicado es el F8A’’, situado en el extremo, la inversión se denomina distal o de tipo 2 (19%
de los casos). Se ha descubierto una tercera variante, minoritaria (3% de los casos), que ocurre en individuos portadores de tres copias extragénicas del gen F8A (Rossiter y col., 1994). Los efectos fenotípicos de los tres tipos de inversiones son, lógicamente, absolutamente idénticos. 

 

Figura 2: Mecanismo de formación de la inversión del intrón 22 del gen FVIIII

 

La inversión del intrón 22 se origina de forma mayoritaria en las células germinales masculinas, según demostró un estudio de marcadores polimórficos que permitió trazar así el origen del cromosoma portador de la mutación entre los ascendientes de individuos afectos. Las familias analizadas no tenían antecedentes de la enfermedad y en casi todos los casos la mutación se originaba en la línea germinal del abuelo materno. Consecuentemente, casi todas las madres eran portadoras de la anomalía. Una más que plausible explicación a este hecho, una vez conocido el mecanismo que da lugar a la inversión del intrón 22, es que durante la meiosis que tiene lugar en la espermatogénesis la falta de un segundo cromosoma X homólogo favorece el encuentro entre los genes F8A y F8A’/F8A’’ cuando el cromosoma se curva sobre si mismo. En el caso de la meiosis que acontece en las células germinales femeninas, el apareamiento de los dos cromosomas X presentes inhibiría dicho encuentro y por tanto la generación de la mutación (Rossiter y col., 1994).
Entre un 40 y un 45% de las hemofilias A graves están originadas por el fenómeno de la inversión del intrón 22 (Antonarakis y col., 1995). Estos elevados porcentajes, que varían poco entre las diferentes poblaciones, la convierten con diferencia en la mutación recurrente más relevante por sus severas consecuencias clínicas y sociales. Por ello el estudio molecular de los hemofílicos graves se inicia en la mayoría de laboratorios, sino en todos, analizando la presencia de la inversión del intrón 22. La técnica clásica para su estudio ha sido la de Southern Blot, la misma que usó Gitschier para confirmar su hipótesis (Lakich y col., 1993). Sin embargo, Liu y colaboradores han descrito recientemente una técnica basada en la amplificación por PCR de múltiples fragmentos genómicos de gran tamaño que supone una notable mejora en la práctica diagnóstica y que se esquematiza en la Figura 3 (Liu y col., 1998; Liu y Sommer, 1998). Si bien la técnica de Southern Blot todavía se utiliza en algunos laboratorios, esta nueva alternativa ha demostrado ser mucho más rápida, cómoda, segura, específica, sensible y económica. Por ello es tan sólo una cuestión de tiempo que la técnica de PCR de fragmentos largos se generalice como técnica de rutina en el estudio de la inversión del intrón 22.

 

Figura 3: Estrategia de PCR de fragmentos largos para la detección de la inversión del intrón 22