Diagnóstico molecular de la Hemofilia
 

El diagnóstico molecular de la hemofilia fue posible a partir de la clonación y caracterización de los genes FVIII y FIX. Sin embargo, y a pesar de que la identificación de ambos genes tuvo lugar de forma prácticamente simultánea, las peculiaridades de cada uno de ellos tales como el tamaño, complejidad estructural, etc. han dado lugar a que las estrategias diagnósticas hayan evolucionado de forma sensiblemente diferente.
 

 

Hemofilia A
 

Técnicas de diagnóstico indirecto
 

Se basan en estudios de ligamiento utilizando marcadores polimórficos intra y/o extragénicos. Estos marcadores consisten en variaciones en la secuencia del genoma de los individuos que permiten un seguimiento del cromosoma portador del gen defectuoso. Estos marcadores polimórficos no tienen ninguna relación con la anomalía y por tanto no proporcionan información respecto al tipo de mutación causante de la enfermedad. Los marcadores intragénicos son los más fiables dado que la probabilidad de recombinación entre éstos y la mutación responsable es menor. Existen diversos polimorfismos intragénicos descritos en el gen FVIII, dos de los cuales consisten en repeticiones en tándem de un dinucleótido y el resto consisten en cambios que alteran dianas de restricción específicas. En la Tabla 1 se recogen los marcadores intragénicos comúnmente utilizados en el diagnostico indirecto de la hemofilia A.
Las repeticiones de dinucleótidos localizadas en los intrones 13 y 22 son del tipo STR (Short Tandem Repeats) y son en la actualidad las de uso más extendido (Dangerfield y col., 1997; Yip y col., 1994). Dado que al ser multialélicas la heterocigosidad poblacional es superior al 50%, que es el máximo porcentaje posible para los polimorfismos dialélicos, y proporcionan por tanto una mayor informatividad. Aproximadamente el 75% de las mujeres de la mayoría de grupos étnicos son heterocigotas para al menos uno de los dos polimorfismos (Goodeve, 1998). De entre las técnicas utilizadas para el estudio de estos polimorfismos STR cabe destacar la de marcaje fluorescente y detección automática tras su separación electroforética (Kochhan y col., 1994).
Los polimorfismos dialélicos han sido también ampliamente utilizados dado que, si bien su grado informatividad es menor, proporcionan una mayor seguridad diagnóstica como estudio complementario adicional. Entre éstos destacan los polimorfismos BclI (da Silva y Figueiredo, 1994; Peake y col., 1993), HindIII y XbaI (De Brasi y col., 1999; Goodeve, 1998).
 

Tabla 1: Polimorfismos intragénicos utilizados en el diagnóstico indirecto de la hemofilia A

 

 

Técnicas de diagnóstico directo
 

El primer paso en el diagnóstico molecular directo de la hemofilia A grave consiste en el análisis de la presencia de la inversión del intrón 22 del gen FVIII, responsable del 40-50% de los casos. Hasta fechas recientes la técnica empleada se basaba en el método de Southern (Southern, 1975). La digestión del DNA genómico con BclI y su posterior transferencia e hibridación utilizando una sonda marcada correspondiente a una región del intrón 22 del gen FVIII da lugar a un patrón de bandas que permite discriminar entre ausencia/presencia del reordenamiento (Lakich y col., 1993). La descripción de esta técnica supuso un gran avance en el diagnóstico molecular de la hemofilia A ya que permitió caracterizar de forma precisa el defecto genético en un elevado porcentaje de los pacientes y posibilitó la realización de estudios fiables tanto de mujeres portadoras como de diagnóstico prenatal (Antonarakis y col., 1995).
Recientemente ha sido descrita una nueva técnica basada en la amplificación simultánea mediante PCR de fragmentos genómicos de gran tamaño correspondientes a la región del intrón 22 del gen FVIII conteniendo el gen F8A y a sus dos copias teloméricas homólogas (Liu y col., 1998; Liu y Sommer, 1998). Tal y como se ilustra en la Figura 6 (Pág. 31), esta técnica utiliza dos pares de oligonucleótidos (AB y PQ) que delimitan las regiones homólogas donde tiene lugar la recombinación. Amplímeros cuyo tamaño varía entre las 10 y las 12 Kb son separados electroforéticamente y el patrón de bandas resultantes permite discriminar entre varones afectos, mujeres portadoras e individuos negativos para la inversión.
Una vez descartada la presencia de la inversión del intrón 22, el estudio de las mutaciones en el gen FVIII se lleva a cabo mediante diversas técnicas, que pueden ser enmarcadas en dos bloques estratégicos:
i) Técnicas de screening de mutaciones: su finalidad es la de analizar regiones o segmentos amplificados del gen de forma que alguna característica físico-química permita diferenciar entre un fragmento control y su homólogo conteniendo una alteración puntual. Se han descrito diferentes técnicas de screening para el diagnóstico molecular de la hemofilia. Todas ellas tienen la peculiaridad común de que tras analizar los diferentes fragmentos y determinar los sospechosos de ser portadores de una mutación éstos deben ser secuenciados para corroborar la existencia de la alteración y si ésta puede ser responsable de la enfermedad. De entre las descritas cabe destacar las siguientes:
Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP). Se basa en la migración electroforética diferencial de las secuencias de DNA de cadena sencilla en las cuales, mutaciones puntuales alteran su estructura secundaria (Orita y col., 1989). Al ser una de las primeras técnicas descritas, numerosos grupos la han empleado para el diagnóstico molecular de la hemofilia A con resultados diversos en términos de eficiencia y sensibilidad (Akkarapatumwong y col., 2000; Economou y col., 1992; Lin y col., 1993; Pieneman y col., 1995; Strmecki y col., 1999).
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE). Los fragmentos de DNA son separados en geles desnaturalizantes en gradiente de urea/formamida. Las variaciones entre secuencias homólogas producen diferencias en su temperatura de fusión y cambios de movilidad en este tipo de geles (Fischer y Lerman, 1980; Fischer y Lerman, 1983). Si bien ha sido empleada por diversos grupos de investigación para la determinación de las alteraciones del gen FVIII (Chan y col., 1996; Higuchi y col., 1991; Higuchi y col., 1991; Lavergne y col., 1992; Schwaab y col., 1995; Traystman y col., 1990), en la actualidad no es una técnica ampliamente utilizada.
Conformational Sensitive Gel Electrophoresis (CSGE). Esta técnica, desarrollada por Ganguly y colaboradores (Ganguly y col., 1993), se basa en la detección de moléculas heterodúplex formadas por la hibridación entre un DNA control y su homologo portador de una mutación. Estas moléculas presentan una movilidad electroforética aberrante que permite diferenciarlas en geles desnaturalizantes (Williams y col., 1998).
Amplification and Mismatch Detection (AMD). Las moléculas heterodúplex formadas por la hibridación entre un DNA control y su homólogo portador de la mutación presentan posición/es de no apareamiento que pueden ser modificadas químicamente y posteriormente cortadas por tratamiento con piperidina. Su posterior electroforesis en geles desnaturalizantes permite establecer el lugar aproximado del corte y por tanto localizar la mutación (Cotton y col., 1988). Ha sido utilizada con relativo éxito por algunos laboratorios (Naylor y col., 1992; Waseem y col., 1999).
Denaturing High Performance Liquid Chromatography (dHPLC). Es la técnica de screening de aparición más reciente (Oefner y Underhill, 1995). Las moléculas heterodúplex presentan tiempos de retención diferentes de los de sus homólogas homodúplex cuando son sometidas a cromatografía líquida en fase reversa en gradiente continuo de acetonitrilo. Este comportamiento permite identificar el fragmento amplificado portador potencial de la alteración para su posterior análisis. Esta técnica ha sido evaluada recientemente por un único grupo para detectar las mutaciones en un total de 183 pacientes afectos de hemofilia A (Oldenburg y col., 2001).
ii) Secuenciación directa: esta aproximación es la más simple conceptualmente ya que consiste en el análisis directo del gen FVIII mediante la determinación de la secuencia de nucleótidos de las regiones consideradas como relevantes. Éstas incluyen los exones, las zonas intrónicas flanqueantes y las regiones implicadas en la regulación de la expresión. Sin embargo, el enorme tamaño del gen FVIII ha disuadido a los diversos laboratorios implicados en el diagnóstico molecular de la hemofilia A de recurrir a la secuenciación sistemática del gen. Por otra parte, ésta ha sido llevada a cabo siguiendo protocolos muy laboriosos que son difícilmente aplicables a la rutina de manera generalizada (Paynton y col., 1991). Ello ha dado lugar a que, hasta fechas muy recientes, el uso de protocolos de secuenciación nucleotídica directa se haya restringido al estudio de mutaciones en aquellos casos en los que otras técnicas no han posibilitado su identificación (Higuchi y col., 1990) o en combinación con otras estrategias tales como las técnicas de screening o de RT-PCR a partir de mRNA ectópico (Bidichandani y col., 1995; Tavassoli y col., 1997).
 

 

Hemofilia B
 

Técnicas de diagnóstico indirecto
 

Hasta fechas recientes las técnicas de diagnóstico indirecto han sido ampliamente utilizadas en los estudios moleculares de la hemofilia B (Toyozumi y col., 1995; Winship y col., 1993; Winship y col., 1989) a pesar de que la región codificante del gen FIX, a diferencia de la del gen FVIII, no es muy extensa. Se han empleado la mayoría de los doce polimorfismos descritos en el gen FIX en los estudios de ligamiento, siete de los cuales se muestran en la Tabla 2. Once corresponden a variaciones dialélicas y uno de ellos es multialélico (Figueiredo y col., 1994; Peake y col., 1993), pudiendo ser todos ellos detectados mediante la técnica de PCR-RFLP.

A diferencia del gen FVIII, existe una marcada variación étnica respecto al grado de heterocigosidad de los polimorfismos del gen FIX, por lo que la elección de los mismos ha de estar condicionada por el origen racial (Goodeve, 1998).
 

 

Tabla 2: Polimorfismos utilizados en el diagnóstico indirecto de la hemofilia B.

 

 

Técnicas de diagnóstico directo
 

i) Técnicas de screening de mutaciones: el mismo tipo de técnicas utilizadas en hemofilia A han sido también empleadas para identificar la mutación en el gen FIX. De forma resumida cabe destacar las siguientes: SSCP (David y col., 1998; David y col., 1993; Mitchell y col., 1999). Mediante esta técnica Montejo y colaboradores identificaron la mutación en un total 76 pacientes, 21 de los cuales presentaban mutaciones no descritas previamente (Montejo y col., 1999). La técnica de DGGE ha sido empleada por dos grupos (Attali y col., 1999; Tartary y col., 1993), permitiendo en el de Attali y colaboradores elucidar la mutación en 68 pacientes. Por último, las técnicas de CSGE (Hinks y col., 1999; Tagariello y col., 2000) y de AMD (Montandon y col., 1989; Rowley y col., 1995) también han sido muy útiles en el diagnóstico molecular de la hemofilia B.
ii) Secuenciación directa: la menor complejidad del gen FIX respecto de la del gen FVIII ha propiciado que diversos laboratorios hayan optado por analizar directamente la mutación mediante la secuenciación exhaustiva de todas las regiones génicas relevantes. De forma general la estrategia utilizada es la secuenciación directa mediante la técnica de dideoxinucleótidos marcados con fluorocromos específicos para cada una de las bases. Weinman y colaboradores determinan la mutación en 26 casos (Weinmann y col., 1998) mientras que el grupo de Costa ha desarrollado más recientemente un protocolo que combina una PCR múltiple de nueve fragmentos que incluyen los ocho exones del gen FIX y su región promotora con la secuenciación cíclica usando terminadores fluorescentes (Costa y col., 2000).
 

 

Diagnóstico de mujeres portadoras
 

Es vital para las mujeres pertenecientes a familias con historial de hemofilia saber si son portadoras o no de la enfermedad, dado que de ello depende la posibilidad de transmitirla a su progenie. El primer paso para conocer su condición de portadoras consiste en la realización de un árbol genealógico de la familia con información clínica fiable de los varones afectados. Dado que su herencia está ligada al cromosoma X es posible diferenciar en una primera instancia entre portadoras obligadas y posibles portadoras. En las primeras, la probabilidad de que uno de sus dos cromosomas X contenga el gen afectado es prácticamente del 100%. Es el caso, por ejemplo, de hijas de padres hemofílicos o de madres de más de un hijo afecto. El estado de posible portadora se da en diversos casos como el de mujeres con familiares hemofílicos por línea materna, hermanas de hemofílicos o mujeres con un hijo hemofílico sin que existan antecedentes familiares. En cambio, una mujer no puede ser portadora si, procediendo de una familia con hemofílicos por vía paterna, su padre no padece la enfermedad.
Existen dos tipos de estudios para la determinación del estado de portadora: el estudio fenotípico y el estudio del DNA o genotípico.
 

 

Estudio fenotípico
 

Las portadoras de hemofilia presentan un nivel de actividad de FVIII o FIX que como promedio oscila entre el 50% y el 75% con respecto del normal, generalmente suficiente para una hemostasia no patológica. Dichos porcentajes son tan solo una referencia aproximada dado que se ha observado que las mujeres portadoras muestran un patrón de variabilidad superior al de mujeres no portadoras (Veltkamp y col., 1968). Dicha gran variabilidad en mujeres portadoras de hemofilia A o B se atribuía al fenómeno de inactivación al azar de uno de los dos cromosomas X que tiene lugar en las primeras fases del desarrollo embrionario. Estudios recientes parecen descartar dicho fenómeno según se desprende de la falta de correlación entre inactivación y concentraciones de factor en plasma (Orstavik y col., 2000). Esta situación, unida a la inherente variabilidad de los niveles en la población normal, da lugar a un notable solapamiento entre ambos grupos de valores que hace difícil establecer la condición de portadora en función de datos fenotípicos. Además, las concentraciones de los factores coagulantes pueden modificarse en diversos estados inflamatorios, enfermedades hepáticas o de otro tipo y tras la administración de determinados medicamentos. Sólo cuando una mujer posible portadora presenta niveles de actividad claramente por debajo de los valores normales se puede asumir de forma razonable que es portadora del gen afectado.
A pesar de las mencionadas limitaciones, y cuando no es posible recurrir al estudio del DNA, el estudio de portadoras de hemofilia A se puede abordar mediante el análisis de dos variantes: el nivel de actividad procoagulante del FVIII (FVIII:C) y los niveles de antígeno FvW circulante. Cuando el cociente entre ambos valores es inferior a 0,5 la probabilidad de que la mujer sea portadora es elevada. Hay que tener en cuenta en este tipo de análisis diversos parámetros como la edad y el grupo sanguíneo, dado que las mujeres de grupo A, B o AB presentan unos niveles más altos que además cambian con los años (Orstavik y col., 1989; Orstavik y col., 1985). En el caso del estudio de portadoras de hemofilia B se utiliza el FIX:C teniendo en cuenta además otros parámetros como la toma de anticonceptivos orales. El nivel de antígeno FIX puede ser de utilidad en algunos casos pero no está justificado determinarlo de forma sistemática.
 

 

Estudio genotípico


Dado que la presencia de niveles normales de actividad coagulante no excluyen el estado de portadora, y de que ni tan sólo niveles alterados lo confirman en muchos de los casos, la detección de portadoras mediante el estudio fenotípico suele ser difícil, algunas veces orientativa y en pocas ocasiones definitiva. Cocientes FVIII:C/ FvWAg anormalmente bajos se han encontrado en personas normales, así como falsos diagnósticos positivos y negativos. Tras la aparición de técnicas que permiten el análisis del DNA, los estudios fenotípicos han quedado en segundo plano, utilizándose como ayuda en aquellos casos en que el estudio de DNA no es posible o no es informativo.
El estudio genotípico se puede abordar mediante técnicas de diagnóstico indirecto o directo, tal y como ya se ha descrito en apartados anteriores. Los procedimientos de diagnóstico indirecto basados en el análisis del ligamiento a partir de marcadores intra o extragénicos han sido fundamentales para poder desarrollar con eficacia el análisis de mujeres posible portadoras. Muchas de las familias que lo han solicitado han podido así disponer de un adecuado consejo genético. Sin embargo existen toda una serie de limitaciones inherentes a estos procedimientos entre las que cabe destacar la imposibilidad de obtener muestras de parientes clave para el estudio, los casos esporádicos en los cuales la ausencia de historial familiar para la enfermedad no permite determinar el cromosoma afecto con garantías, la posibilidad de que tenga lugar una recombinación entre el marcador utilizado y el gen afecto y la falta de informatividad de los marcadores utilizados (Goodeve, 1998).
La incorporación de técnicas de diagnóstico molecular destinadas a caracterizar la mutación en cada paciente soluciona muchas de las limitaciones anteriormente mencionadas. Una vez encontrado el defecto genético en el paciente no es necesario volver a analizar todo el gen en la mujer o mujeres con riesgo de ser portadoras ya que la amplificación por PCR del fragmento génico implicado y su posterior secuenciación son suficientes para asegurar el resultado con casi total garantía. Una excepción a dicha afirmación la encontramos en los casos de mutaciones causadas por mosaicismo germinal. En estas circunstancias una mujer cuando se trata de mujeres emparentadas con pacientes hemofílicos esporádicos. Así, la ausencia de mutación en el genoma de determinadas células somáticas (los linfocitos suelen ser la muestra habitual de análisis) de una mujer que ha tenido un hijo hemofílico sin antecedentes familiares para la enfermedad no descarta que parte de su línea germinal sea portadora del cromosoma afecto. Cuando se da una verdadera mutación de novo en el hijo, entonces se trataría de un mosaicismo somático que no podría tener consecuencias sobre sus futuros hermanos. La presencia de mosaicismos germinales y somáticos se ha comprobado en ambos tipos de hemofilia si bien su importancia como origen de la patología esta posiblemente infravalorada. Ello es debido a limitaciones de sensibilidad ya que, salvo contadas excepciones, los métodos habitualmente utilizados aseguran eficacia en la detección de aquellos casos de mosaicismo en que la mutación se encuentra en al menos el 5% del DNA total (Saad y col., 1994).
 

 

Diagnóstico prenatal


Hasta el principio de la década de los setenta, la recomendación habitual para muchas de las mujeres que eran portadoras obligadas, o incluso posibles portadoras, era la de abstenerse de tener descendencia. Un avance supuso, en aquellas familias que deseaban un estudio prenatal, la determinación del sexo en el feto mediante amniocentesis en la semana 15-16 de gestación. Sin embargo ello suponía que un 50% de los fetos varones sufrían interrupción del embarazo a pesar de ser sanos (Tedgard, 1998).
Desde 1979 ha sido posible identificar a los fetos afectos de hemofilia en familias de riesgo mediante la toma de pequeñas cantidades de sangre obtenidas directamente por punción de la vena umbilical a las 18-22 semanas de gestación, gracias a las técnicas de seguimiento ecográfico y a la determinación de la actividad coagulante del FVIII o FIX (Mibashan y col., 1979). Dos importantes limitaciones de esta técnica, denominada funiculocentesis, son su elevado riesgo de aborto (2%) y la avanzada fase de gestación en la que se realiza. Esto conlleva a menudo secuelas psicosomáticas serias en caso de producirse finalmente la interrupción del embarazo, ya sea por causas técnicas o diagnósticas (Tedgard y col., 1989).
Todos estos métodos han sido superados por la aplicación de las técnicas de diagnóstico molecular directamente sobre el DNA fetal. Existen dos tipos de procedimientos para la obtención de la muestra fetal y ambos se basan, al igual que la funiculocentesis, en técnicas invasivas si bien el riesgo de aborto que conlleva su práctica es inferior. El método más ampliamente utilizado actualmente para el diagnostico molecular prenatal es la biopsia de corion, la cual contiene una muestra de vellosidades coriales cuyo genoma es idéntico al fetal. Un segundo método no tan extendido es la amniocentesis u obtención del líquido amniótico. Ambos métodos tienen sus ventajas e inconvenientes. Así, la biopsia corial se puede realizar a partir de las 10-11 primeras semanas de gestación mientras que la extracción de líquido amniótico se efectúa a partir de la semana 14, lo cual supone un retraso diagnóstico a considerar en términos médicos y sociales. Sin embargo la biopsia corial requiere un análisis morfológico adicional para confirmar que el material extraído es de origen fetal y no materno, posibilidad que es preciso descartar completamente para evitar posibles errores diagnósticos. Por otra parte el riesgo de aborto en este último caso es ligeramente superior al de la amniocentesis.
Una alternativa a dichos métodos consiste en la obtención de líquido amniótico en estadíos tempranos de la gestación mediante el procedimiento denominado amniofiltración. Esta técnica consiste en la obtención, mediante microfiltración en circuito cerrado, de la fracción celular y el retorno del líquido amniótico sobrante al saco embrionario (Sundberg y col., 1993). De esta forma se pueden obtener cantidades suficientes de material fetal a las 11 semanas de gestación, fase temprana comparable a la de las vellosidades coriales, pero con un riesgo de aborto inferior y una menor probabilidad de contaminación por DNA materno. Sin embargo la utilización de esta técnica se halla restringida a aquellos centros hospitalarios que dispongan de personal adecuadamente cualificado para su realización.
Las técnicas de diagnóstico molecular utilizadas incluyen tanto el diagnóstico indirecto mediante estudios de análisis de ligamiento de marcadores intra o extragénicos como las técnicas de diagnóstico directo. Entre estas últimas la técnica de elección es la secuenciación nucleotídica directa dado que obvia los problemas asociados a las técnicas indirectas, tales como la probabilidad de recombinación y la falta de informatividad de los marcadores polimórficos.